Het effect van voedingsstoffensynergie op menselijke osteosarcoomcellen U-2OS

M. Waheed Roomi, Vadim Ivanov, Matthias Rath en Aleksandra Niedzwiecki

Matthias Rath, Inc., R&D, Cancer Division, Santa Clara, CA 95050

Titel: Het antitumoreffect van voedingsstoffensynergie op osteosarcoomcellen
Trefwoorden: osteosarcoom, MMP, voedingsstoffensynergie, antitumoreffect

Corresponderende auteur - Aleksandra Niedzwiecki, Ph.D.
1260 Memorex Drive
Santa Clara, CA, 94050 USA
Telefoon - (+1)408-567-5564
Fax - (+1)408-986-9403
E-mail - a.niedz@drrath.com

Uittreksel

Inleiding:
De huidige behandeling van osteosarcoom, een primaire kwaadaardige tumor in botten of zachte delen die voortvloeit uit botvormende mesenchymale cellen, leidt tot een slechte prognose, met name vanwege de verhoogde kans op het ontstaan van andere kankers als gevolg van chemotherapie. Om deze reden zijn er nieuwe behandelingsstrategieën nodig die effectief zijn zonder toxische bijwerkingen. Recente in vitro-onderzoeken die in ons laboratorium zijn uitgevoerd hebben aangetoond dat voedingsstoffensynergie (VS), een unieke formule op basis van lysine, proline, arginine, ascorbinezuur en epigallocatechinegallaat, een chemopreventief effect heeft op verschillende typen kanker. VS liet een potentiële synergetische antikankerwerking zien door matrixmetalloproteïnases te remmen. Deze enzymen spelen een belangrijke rol bij invasie en metastase.

Doelstelling:
We onderzochten het effect van voedingsstoffensynergie op menselijke osteosarcoomcellen U-2OS door het meten van: de cytotoxiciteit, modulatie van matrixmetalloproteïnases (MMP's): MMP-2 en MMP-9 en het invasiepotentieel.

Methoden en hulpmiddelen:
Menselijke osteosarcoomcellen U-2 Os werden in McCoy-medium gekweekt en aangevuld met 10% foetaal bovien serum en antibiotica op microtiterplaten met 24 containers. Nabij het confluentiepunt werden de cellen behandeld met voedingsstoffensynergie, bij elke dosis 0, 10, 50, 100, 500 en 1,000µg/ml in drievoud. De cytotoxiciteit werd beoordeeld door middel van het celaantal dat na 24 uur in een MTT-test werd gemeten. De MMP-expressie werd beoordeeld door middel van gelatinase-zymografie in conditiemedia en de invasie door middel van Matrigel.

Resultaten:
Voedingsstoffensynergie was niet giftig bij een dosis van 10µg/ml en liet een dosis-effectgiftigheid van maximaal 60% boven de controle op 1000µg/ml. Zymografie wees een dosisonafhankelijke remming uit van MMP-2- en MMP-9-expressie door voedingsstoffensynergie. Bij een concentratie van 500µg/ml was er sprake van een vrijwel volledige remming. De invasie van osteosarcoomcellen door Matrigel bleek significant verminderd bij een dosis van 50µg/ml (74%) en volledig geremd bij een concentratie van 100µg/ml.

Conclusie:
Onze resultaten duiden erop dat voedingsstoffensynergie een uitstekende kandidaat is voor therapeutisch gebruik bij de behandeling van osteosarcoom vanwege het remmend effect op de MMP-expressie, angiogenese en invasie. Dit zijn stuk voor stuk veelbelovende parameters voor kankerpreventie.

Introductie

Osteosarcoom, een belangrijke kwaadaardige tumor van botten of zachte delen die voortvloeit uit botvormende mesenchymale cellen, ontwikkelt zich gewoonlijk in de distale femur, proximale tibia, de proximale humerus en de distale radius. Klassiek osteosarcoom laat een agressieve, snelle groei zien met een hoog risico op lokale, "overspringende" metastasen en vroege pulmonale metastase. Het is de meest voorkomende vorm van botkanker en de op vijf na meest voorkomende kanker bij kinderen. Deze kanker ontstaat doorgaans bij adolescenten die een groeispurt doormaken en komt vaker voor bij mannelijke dan vrouwelijke patiënten. De meeste osteosarcomen zijn het gevolg van niet-erfelijke fouten in het DNA of de groeibotcellen. Omdat deze fouten op willekeurige en onvoorspelbare wijze optreden tijdens intense botgroei is er momenteel geen effectieve behandeling bekend om dit type kanker te voorkomen (1).

Huidige behandelingen van osteosarcoom zijn operatieve ingrepen (amputatie of een ledemaatreddende operatie) en chemotherapie. Deze behandelingen worden uitgevoerd als er sprake is van een slechte prognose, voornamelijk als gevolg van het sterk invasieve karakter van deze kanker, de verhoogde kans op metastase en de ontwikkeling van andere kankers die met chemotherapie gepaard gaan. Een voorbeeld: van 31 onderzochte patiënten met een lokaal osteosarcoom (2) die werden behandeld met conventionele chemotherapie (hoge doses methotrexaat en leucovarineredding bij 3 patiënten en intra-arteriële cisplatine bij 28 patiënten) bij het Anderson Cancer Center kwam er bij 3 patiënten geen lokale pulmonale metastase terug tijdens de volgperiode van 225+ maanden. Bijwerkingen van chemotherapie zijn onder andere: bloedarmoede, abnormale bloedingen, een verhoogde kans op infectie als gevolg van de vernietiging van beenmerg, schade aan de lever en nieren, een onregelmatige menstruatie, blaasontsteking en bloed in de urine, huid- en hartproblemen en gehoorverlies. Bij ongeveer 20% van alle kinderen bij wie de diagnose van osteosarcoom is gesteld is sprake van een geavanceerd stadium van osteosarcoom, osteosarcoom dat naar de longen, hersenen en andere botten is gemetastaseerd (1).

Een van de belangrijkste mechanismen voor de verspreiding van kankercellen en hun metastase in het menselijk lichaam is de vernietiging van enzymen van het omringende bindweefsel. Behandelingsmethoden op basis van specifieke geneesmiddelen zijn niet effectief gebleken voor het beheersen van dit proces. Momenteel zijn er geen middelen beschikbaar die de metastase van kanker kunnen beheersen. Decennia lang werd osteosarcoom standaard behandeld door middel van operatie en chemotherapie. Deze zijn op de vernietiging van kankercellen gericht en doen niets aan de metastase. Bestraling en chemotherapie zijn niet alleen ineffectief gebleken qua genezing, maar vallen daarnaast zonder enig onderscheid alle cellen aan. Hierdoor ontstaat celschade en wordt het bindweefsel van het lichaam vernietigd. Uiteindelijk werkt dit de metastase van kanker in de hand. Het is duidelijk dat er veilige en effectieve natuurlijke behandelingen nodig zijn voor het beheersen van het kankermetastaseproces.

Alle typen kankercellen vormen tumoren en verspreiden zich door het lichaam door de extracellulaire matrix (ECM) te degraderen door middel van verschillende matrixmetalloproteïnases (MMP's). De werking van deze enzymen verhoogt de agressiviteit van de tumorgroei en het invasieve karakter van de kanker. In 1992 stelden Rath en Pauling (3) dat bouwstoffen zoals lysine en ascorbinezuur konden fungeren als natuurlijke inhibitoren van ECM-proteolyse en daarom het potentieel hebben om de groei en expansie van tumors te moduleren. Deze voedingsstoffen kunnen hun antitumorwerking uitoefenen door middel van verschillende mechanismen, onder andere door MMP's te remmen en het bindweefsel rondom kankercellen te versterken (tumorinkapselend effect). In een eerder onderzoek toonden wij het antiproliferatiepotentieel aan van lysine, ascorbinezuur, proline en epigallocatechinegallaat (ECGC) op borstkanker (MDA-MB 231), dikke darmkanker (HCT 116) en melanoom (A2058)-cellijnen(4) bij mensen. voedingsstoffensynergie bleek daarnaast de groei van deze tumoren zonder enige nadelige bijwerkingen te onderdrukken bij naakte muizen. Voor het huidige onderzoek onderzochten wij het antitumorpotentieel van voedingsstoffensynergie in vitro in relatie tot de menselijke osteosarcoom U-2 OS-cellijn.

Doelstelling:

We onderzochten hef effect van voedingsstoffensynergie op menselijke osteosarcoomcellen U-2OS door het meten van: de cytotoxiciteit, modulatie van matrixmetalloproteïnases (MMP's): MMP-2 en MMP-9 en het invasiepotentieel.

Methoden en hulpmiddelen:

Celcultuur
Menselijke osteosarcoomcellen U -2 OS werden verkregen van het ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) en gekweekt in McCoy-medium aangevuld met 10% foetal bovien serum, penicilline (100 U/ml) en streptomycine (100 mg/ml) in microtiterplaten met 24 containers (Costar, Cambridge, MA). Cellen werden geïncubeerd met 1 ml media bij een temperatuur 37 0 C in een weefselcultuurincubator gebalanceerd met 95% lucht en 5% C0 2. Nabij het confluentiepunt werden de cellen behandeld met voedingsstoffensynergie, opgelost in media en getest bij 0, 10, 100, en 1000µg/ml in drievoud bij elke dosis. De platen werden vervolgens naar de incubator teruggebracht. Na 24 uur werd de cytotoxiciteit beoordeeld met behulp van testreagentia.

MTT-test
De levensduur/cytotoxiciteit werd beoordeeld op basis van de celproliferatie door middel van de MTT-test, zowel in serumvrije media en media aangevuld met 10% FBS. Seriumvrije media uit cellen werden opgeslagen en op MMP's getest. De cellen in de platen werden overgoten met fosfaat-gebufferd zout (PBS) en aan elke container werd 500µl MTT (Sigma #M-2128) 5mg/ml PBS toegevoegd. De microtiterplaten werden gedurende nog eens 2 uur geïncubeerd bij een temperatuur van 37 0 C. Het medium werd voorzichtig opgezogen en aan elke container werd 1 ml DMSO (dimethylsulfoxide) toegevoegd om de afgezette blauwe formazankristallen op te lossen. De optische dichtheid werd gemeten op 590n. De OD 550 van DMSO-oplossing in de container werd direct met de BioSpec 1601, Shimadzu-spectrofotometer bestudeerd. Van de OD 590 van de DMSO-oplossing in elke container werd aangenomen dat deze verband hield met het aantal cellen. De OD 590 van de controle (behandeling zonder supplement) werd op 100% gesteld.

Gelatinase-zymografie
De MMP-expressie in de conditiemedia werd vastgesteld door middel van gelatinase-zymografie. De gelatinase-zymografie werd uitgevoerd in 10% polyacrylamidegel (Bio-Rad, Hercules, CA) bij een aanwezigheid van 0,1% gelatine. Kweekmedium (20µl) werd geladen en SDS-PAGE werd uitgevoerd met een trisglycine SDS-buffer. Na elektroforese werden de gels gedurende 30 minuten met 5% Triton X-100 overgoten. Na de spoeling werden de gels 24 uur lang geïncubeerd bij een temperatuur van 37 0 C in aanwezigheid van 50mM Tris-HCl, 5mM CaCl 2 , 5µM, ZnCl 2 , PH 7,5 en gedurende 30 minuten gekleurd met Coomassie Blue R 0,5% en vervolgens weer ontkleurd. De proteïnestandaarden werden gezamenlijk uitgevoerd en de moleculaire gewichten werden ingeschat.

Matrigel-invasieonderzoeken
Invasiestudies werden uitgevoerd met behulp van Matrigel (Becton Dickinson)-toevoegingen in microtiterplaatjes met 24 containers. Osteosarcoomcellen gesuspendeerd in media aangevuld met voedingsstoffen zoals aangegeven in het experimentontwerp werden gezaaid op het tussenstuk in de container. Op deze manier bevatte het medium op het tussenstuk en in de container dezelfde voedingsstoffen. De plaatjes met de tussenstukken werden vervolgens gedurende 24 uur geïncubeerd in een cultuurincubator gebalanceerd met 95% lucht en 5% C0 2. Na incubatie werden de media uit de containers verwijderd. De cellen op het bovenoppervlak van de tussenstukken werden zachtjes weggeschrobt met katoenen staafjes. De cellen die het Matrigel-membraan hadden gepenetreerd en naar het onderoppervlak van de Matrigel waren gemigreerd werden gekleurd met Hematoxylin en Eosin en met het oog geteld onder de microscoop.

Tabel 1 - Samenstelling van voedingsstoffensynergie
Een voorraadoplossing van voedingsstoffensynergie, volgens de onderstaande verhoudingen geprepareerd, werd opgelost in media zoals aangegeven in het experimentontwerp voor de behandeling van cellen.

Statistische analyse
De resultaten werden uitgedrukt als het gemiddelde + SE voor elke groep. De gegevens werden geanalyseerd door middel van een onafhankelijk t-steekproef.

Resultaten

1. Osteosarcoom cytotoxiciteit/proliferatie-onderzoek
Voedingsstoffensynergie bleek niet cytotoxisch bij 10 µg/ml en liet een dosis-effectgiftigheid zien met een maximale giftigheid van 60% tijdens de controle bij 1000 µg/ml, zoals weergegeven in figuur 1. De resultaten waren statistisch gezien relevant (P < 0,01)

Figuur 1 - Het effect van voedingsstoffensynergie (VS) op de groei van menselijke osteosarcoomcellen U-2OS (24-uurs MTT-test)

2. Gelatinase-zymografieonderzoek
Zoals weergegeven in figuur 2 wees zymografie op een expressie van MMP-2 en MMP-9 bij menselijke osteosarcoom U-2OS-cellen; voedingsstoffensynergie remde de expressie van beide MMP's op dosisafhankelijke wijze. Bij een concentratie van 500µg/ml was sprake van vrijwel volledige remming.

Figuur 2 - Het effect van voedingsstoffensynergie op de MMP-2- en MMP-9-expressie van osteosarcoomcellen

1-markers, 2-controle, 3-7 voedingsstoffensynergie 10, 50, 100, 500, 1000 µg/ml

3. Invasieonderzoek
De invasie van osteosarcoomcellen door Matrigel was significant verminderd bij 50µg/ml (74%) en volledig geremd bij een concentratie van 100µg/ml.

Figuur 3 - Het effect van voedingsstoffensynergie op de invasie van osteosarcoomcellen

Figuur 4 - Invasieonderzoek: Hematoxyline & en met eosine gekleurde microfoto's

Discussie

De resultaten van dit onderzoek toonden een aanzienlijke antiproliferatiewerking (~60% remming bij 1000 µg/ml) zonder morfologische verandering en drastische anti-invasieve effecten van voedingsstoffensynergie in vitro bij de menselijke osteosarcoomcellijn U-2OS. De invasie van Matrigel door MMP-2- en MMP-9-expressies van osteosarcoomkankercellen verminderde op dosisafhankelijke wijze. Bij respectievelijk 100µg/ml en 500 µg/ml was sprake van een volledige remming van invasie en MMP-expressie.

Matrixinvasie kan worden beheerst door het remmen van de MMP-expressie en het verhogen van de kracht en stabiliteit van bindweefsel. Dit draagt bij aan de "inkapseling" van de tumor. Het onderzoek wees uit dat het dosisafhankelijk remmingseffect van voedingsstoffensynergie op de MMP-9- en MMP-2-expressie van osteosarcoomcellen consistent was met de dosisafhankelijke remming van matrixinvasie. De matrixinvasie waarschijnlijk eveneens gemoduleerd door de verbetering van de stabiliteit en kracht van het bindweefsel als tweede factor na de activiteit van de voedingsstoffen waaruit voedingsstoffensynergie bestaat. De optimalisatie van de synthese en structuur van collageenfibrillen is afhankelijk van de hydroxylatie van hydroxylysineresten in collageenvezels. Het is algemeen bekend dat ascorbinezuur een essentiële rol speelt bij de hydroxylatie van deze aminozuren. Ascorbinezuur en lysine worden niet in het lichaam aangemaakt, zodat er in de verschillende ziektestadia geen optimale niveaus van deze voedingsstoffen mogelijk zijn. Ook kan er sprake zijn van een ontoereikend dieet. Hoewel proline kan worden gesynthetiseerd uit arginine, kan de synthese en/of hydroxylatie van proline worden beïnvloed in bepaalde pathologische omstandigheden.

De remmende effecten van de afzonderlijke voedingsstoffen waaruit voedingsstoffensynergie is opgebouwd blijken zowel uit klinisch als experimenteel onderzoek. Ascorbinezuur heeft mogelijk een cytotoxisch en antimetastatisch effect op kwaadaardige cellijnen (5)(6)(7); Daarnaast werden er lage niveaus ascorbinezuur aangetroffen bij kankerpatiënten (8) (9) (10). ECGC is een krachtig middel tegen kanker waarvan is vastgesteld dat het een groeiremmend effect heeft op bepaalde menselijke kankercellijnen (11,12, 13).

De voedingsstoffen afzonderlijk blijken echter niet dezelfde kracht te hebben als voedingsstoffensynergie als geheel. Onze vorige onderzoeken toonden aan dat het synergetische antikankereffect van ascorbinezuur, proline, lysine en EGCG op verschillende kankercellijnen in weefselcultuuronderzoeken groter was dan dat van de voedingsstoffen afzonderlijk (14). Bovendien toonden morfologische onderzoeken aan dat zelfs bij de hoogste concentraties van voedingsstoffensynergie de osteosarcoomcellen niet werden beïnvloed, in tegenstelling tot chemotherapie, die zowel zieke als gezonde cellen en ECM's schaadt. Dit bewijst de celvriendelijkheid van deze formule.

Conclusies

Onze resultaten wijzen erop dat voedingsstoffensynergie uitstekend geschikt is voor therapeutisch gebruik tijdens de behandeling van uiterst agressieve osteosarcoomkanker als gevolg van de remmende werking op de celproliferatie, MMP-expressie en invasie.

Literatuurverwijzingen

1. Miller R, Dowshen S, en Trigg M, Childhood Cancer: Osteosarcoma (May 2002) The Nemours Foundation: Kids Health
2. Jaffe N, Carrasco H, Raymond K, Ayala A, Eftekhari F (2002). Can cure in patients with osteosarcoma be achieved exclusively with chemotherapy and abrogation of surgery? Kanker 10, 2202-10.
3. Rath M en Pauling L (1992). Plasmin-induced proteolysis and the role of apoprotein(a), lysine and synthetic analogs Orthomoleculare geneeskunde. 7 ,17-23)
4. Netke SP, Roomi MW, Ivanov V, Niedzwiecki A, en Rath M (2003). A specific combination of ascorbic acid, lysine, proline and epigallocatechin gallate inhibits proliferation and extracellular matrix invasion of various human cancer cell lines. Research Communications in Pharmacology and Toxicology
5. Koh WS, Lee SJ, Lee H, Park C, Park MH, Kim WS Yoon SS, Park K, Hong SI, Chung MH, Park CH. (1998) Differential effects and transport kinetics of ascorbate derivatives in leukemic cell lines. Anticancer Res 8 , 2487-2493.
6. Roomi MW, House D, Eckert-Maksic M, Maksic ZB, Tsao CS(1998). Growth suppression of malignant leukemia cell line in vitro by ascorbic acid (vitamin C) and its derivatives. Cancer Letters 122 , 93-99.
7. Naidu KA, Karl RC, Naidu KA, Coppola D (2003). Antiproliferative and proapoptotic effect of ascorbyl stearate in human pancreatic cancer cells: association with decreased expression of insulin-like growth factor 1 receptor. Dig Dis Sci 48 (1), 230-7.
8. Anthony HM, Schorah CJ (1982). Severe hypovitaminosis C in lung-cancer patients: The utilization of vitamin C in surgical repair and lymphocyte related host resistance. Br J Cancer 46 , 354-367
9. Nunez C, Ortiz de Apodaca Y, Ruiz A (1995). Ascorbic acid in the plasma and blood cells of women with breast cancer. The effect of consumption of food with an elevated content of this vitamin. Nutr Hosp . 10 , 68-372.
10. Kurbacher CM, Wagner U, Kolster B, Andreotti PE, Krebs D, Bruckner HW (1996). Ascorbic acid (vitamin C) improves the antineoplastic activity doxorubicin, cisplatin and paclitaxel in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Lett . 103 (2),183-189.
11. Valcic S, Timmerman BN, Alberts DS, Wachter GA, Krutzch M, Wymer J, Guillen JM (1996). Inhibitory effects of six green tea catechins and caffeine on the growth of four selected human tumor cell lines. Anticancer Drugs . 7, 461-468.
12. Mukhtar H en Ahmed N (2000). Tea polypheonols: prevention of cancer and optimizing health. Am J Clin Nutr . 71, 1698S-1720S.
13. Yang GY, Liao J, Kim K, Yurkow EJ, Yang CS (1998). Inhibition of growth and induction of apoptosis in human cancer cell lines by tea polyphenols. Carcinogenesis. 19, 611-616.
14. Netke SP, Roomi MW, Ivanov V, Niedzwieck A, and Rath M. A specific combination of ascorbic acid, lysine, proline and epigallocatechin gallate inhibits proliferation and extracellular matrix invasion of various human cancer cell lines.